O óxido nítrico (NO), presente no smog e na fumaça do cigarro, é considerado um poluente atmosférico há longa data,  um destruidor da camada de ozônio e um precursor da chuva ácida. Desde a descoberta em 1987 da semelhança entre o NO e o EDRF (Endothelium Derived Relaxing Factor), sua importância na regulação de funções orgânicas, incluindo as do trato respiratório, tem sido salientada.

O NO é a menor molécula com atividade biológica conhecida até o momento. Sua meia-vida é de 1 – 5 segundos. É uma importante molécula mensageira, desempenhando um importante papel em muitos processos fisiológicos e patológicos. Ele regula uma variedade de funções dentro das células e tecidos, como vasodilatação, neurotransmissão e processos imunológicos. O NO participa na patogênese da asma brônquica porém seu preciso papel ainda não foi definido. O NO atua como um neurotransmissor com ação relaxante sobre o músculo liso das vias aéreas, via nervos não-adrenérgicos não-colinérgicos (NANC). Quando produzido em altas concentrações na árvore traqueobrônquica pela dioxigenase, chamada sintase indutível do óxido nítrico (iNOS), presente em várias células inflamatórias, determina hiperemia, edema, exsudação, secreção de muco e proliferação de linfócitos TH2, os responsáveis pela proliferação eosinofílica, contribuindo para a inflamação das vias aéreas em pacientes com asma. O NO é produzido por uma grande variedade de células como as células epiteliais, as células nervosas, as células inflamatórias (neutrófilos, macrófagos, mastócitos) e as células endoteliais.

O NO encontra-se presente normalmente no ar expirado do homem e de vários animais, estando significativamente aumentado no ar expirado e no escarro induzido de asmáticos (Figura 1).^1,2 Os níveis elevados de NO exalado na asma estão intimamente ligados ao pH das vias aéreas, que provavelmente é consequência da ação direta do gás no processo patogênico da asma.^3-5

O NO foi primeiro identificado como Endothelial-Derived Relaxing Factor (EDRF). Em 1993, Hamid et al.⁶ efetuaram um estudo utilizando biópsias brônquicas e detectaram a enzima sintase do óxido nítrico (NOS) no epitélio de 22 de 23 asmáticos, e em apenas 2 de 20 do grupo controle.

O óxido nítrico exalado (FeNO) encontra-se aumentado na asma atópica, aumenta durante as exacerbações, diminui com a terapia anti-inflamatória⁷ e aumenta quando as doses de corticoides inalados são reduzidas (Figura 2).⁸ Os níveis de FeNO correlacionam-se com o número de eosinófilos no escarro induzido,^1,2,9 com os níveis de proteína catiônica eosinofílica (ECP), com a proteína X eosinofílica (EPX) urinária, com a hiper-responsividade brônquica à adenosina-5'-monofosfato (AMP)¹⁰ e com o exercício. O NO é uma molécula gasosa onipresente que regula muitos aspectos da biologia das vias aéreas humanas, incluindo o tônus muscular liso vascular e brônquico.¹¹

Como instrumento de diagnóstico os níveis de FeNO discriminam asmáticos de não-asmáticos, com alta sensibilidade e especificidade.¹² A FeNO tem sido preconizada como uma nova prova de função pulmonar e recomendado como forma de monitorar o grau de inflamação das vias aéreas na asma, existindo evidências de que seja o primeiro marcador a aumentar durante o agravamento da doença.

 

O NO é um gás livremente difusível, formado a partir do aminoácido semi-essencial L-arginina (desaminação), quando de sua transformação em L-citrulina, reação mediada pela enzima sintase do óxido nítrico (NOS).

A NOS catalisa uma oxidação de cinco elétrons de um nitrogênio amidina da L-arginina. N-hidroxi-L-arginina é um intermediário que permanece firmemente ligado à enzima. Os produtos finais desta reação enzimática são em quantidades equimolares, o NO e a L-citrulina, formados através de monoxidação com Nw– hidroxiarginina que  é um intermediário que permanece ligado firmemente à enzima. Este processo requer oxigênio como um cosubstrato e NADPH como fonte de elétrons. A NOS consiste em uma enzima muito complexa, empregando cinco cofatores redox: NADPH, FAD (flavina adenina dinucleotídeo), FMN (flavina mononucleotídeo), heme e tetraidrobiopterina (BH 4) (Figuras 3,4).^13-15 O NO tem uma meia-vida muito curta nos tecidos (1-5 segundos), pois reage com o oxigênio e superóxido. O NO é um gás altamente lábil, não estocável, difunde-se com facilidade do local de formação até o sítio de ação pois é solúvel tanto na água como em lipídios, difundindo-se livremente nos tecidos. Apresenta uma ação típica de segundo mensageiro para células-alvo, onde ativa o sistema guanilciclase, com o aumento da produção de guanidina monofosfato cíclico (GMPc), através do qual determina vários efeitos biológicos (neurotransmissão, vasodilatação, broncodilatação, ...).¹⁶

Pelo menos três tipos de isômeros da NOS estão identificados.¹⁷ Dentre as isoformas chamadas constitutiva (cNOS) temos a encontrada na célula neuronal (tipo I ou nNOS); a indutível NOS (tipo II ou iNOS) e a constitutiva endotelial NOS (NOS III ou eNOS). A iNOS (expressão inibida pelo corticoide) ou tipo II tem sua produção estimulada e aumentada na inflamação, por citocinas e outros mediadores de várias células, incluindo macrófagos, linfócitos, fibroblastos, células epiteliais e musculares lisas das vias aéreas. As nNOS, iNOS e eNOS são produtos de genes distintos, localizados em diferentes cromossomos humanos (cromossomos 12, 17 e 7 respectivamente), cada um com certas características e expressão tecidual específica. Dentre as citocinas, aumentam a expressão da NOS in vitro, o TNF-α, IFN-γ e a IL-1β.¹⁸

Pelo menos três tipos de isômeros da NOS estão identificados.¹⁷ Dentre as isoformas chamadas constitutiva (cNOS) temos a encontrada na célula neuronal (tipo I ou nNOS); a indutível NOS (tipo II ou iNOS) e a constitutiva endotelial NOS (NOS III ou eNOS). A iNOS (expressão inibida pelo corticoide) ou tipo II tem sua produção estimulada e aumentada na inflamação, por citocinas e outros mediadores de várias células, incluindo macrófagos, linfócitos, fibroblastos, células epiteliais e musculares lisas das vias aéreas. As nNOS, iNOS e eNOS são produtos de genes distintos, localizados em diferentes cromossomos humanos (cromossomos 12, 17 e 7 respectivamente), cada um com certas características e expressão tecidual específica. Dentre as citocinas, aumentam a expressão da NOS in vitro, o TNF-α, IFN-γ e a IL-1β.¹⁸

As cNOS e iNOS podem ser obtidas através de cultura de células epiteliais respiratórias^19-21 embora a expressão iNOS predomine in vivo. Biópsias transbrônquicas obtidas em asmáticos, utilizando coloração imuno-histoquímica demonstram aumento da atividade iNOS, quando comparadas com não-asmáticos.³

Quanto ao seu metabolismo o NO após a sua formação se decompõe em outros óxidos de nitrogênio, chamados nitrito (NO₂^-), produto da reação do NO com oxigênio molecular (O₂) em fase aquosa e trióxido de dinitrogênio (N₂O₃). Também reage com superóxido para peroxinitrito (ONOO^-). O peroxinitrito está em equilíbrio com o ácido peroxinitroso (ONOOH), formados a partir da reação com o radical superóxido (O₂^-). Estes óxidos de nitrogênio também reagem com uma variedade de outras moléculas para formar numerosos produtos biologicamente ativos. A magnitude destas modificações se correlaciona com o grau de estresse oxidativo e nitrosativo.

Estudos sugerem que a asma possa ser uma condição de biodisponibilidade reduzida de NO,^22,23 ao invés de uma superprodução como resultado de inflamação.^24,25 Isso pode ocorrer em parte como resultado da atividade patologicamente elevada da enzima arginase,^26-28 uma enzima que hidrolisa L-arginina em L-ornitina e ureia. A L-arginina funciona como substrato para a enzima arginase e para a sintase do óxido nítrico (cNOS e iNOS). Como ambas, a arginase e a NOS utilizam a arginina como substrato comum, a arginase pode desempenhar um papel na regulação da síntese de NO, modulando a disponibilidade de L-arginina. A L-arginina é um aminoácido semiessencial metabolizado por várias enzimas, incluindo a iNOS no citosol e pela arginase-2 nas mitocôndrias.²⁹

Uma recente teoria sobre a asma relaciona a L-arginina, a arginase e o NO endógeno (Figura 5).³⁰ A arginase 1 e a arginase 2 controlam a transformação da L-arginina em L-ornitina, que por sua vez dá origem a L-prolina e poliaminas.^31,32 A arginase 1 é uma proteína citoplasmática que participa do ciclo da biossíntese da ureia, sendo expressa primariamente em grande quantidade no fígado. A arginase 2 é uma proteína mitocondrial expressa em vários tecidos, principalmente na próstata e nos rins.³³ A exata função da L-arginina extra-hepática agora é que começa a ser esclarecida. Entretanto, o aumento de sua expressão é capaz de aumentar a síntese da L-prolina e/ou poliaminas, como a putrescina, espermidina e espermina, essenciais no metabolismo que controla a produção e proliferação de colágeno, com efeitos no tecido conjuntivo e a proliferação de músculo liso vascular,³⁴ de células endoteliais³⁵ e sintese de muco.^31,32 As arginases 1 e 2 são expressas constitutivamente nas vias aéreas, particularmente no epitélio brônquico e nos fibroblastos.^23,36,37

Morris et al.²⁸ avaliaram em um grupo de pacientes com asma os níveis de arginase e da L-arginina plasmáticos. Quando comparados ao grupo controle, os pacientes com asma exibiram uma redução notável nos níveis plasmáticos da L-arginina em comparação com indivíduos normais sem asma (45 ± 22 versus 94 ± 29 µM, p< 0,0001), enquanto que a atividade sérica da arginase estava elevada (1,6 ± 0,8 versus 0,5 ± 0,3 µmol/ml/hora, asma v. controle, p< 0,0001) (Figura 6). A alta atividade da arginase em asmáticos pode contribuir para baixos níveis circulantes de L-arginina, limitando a biodisponibilidade da L-arginina e criando uma deficiência de NO o que induz a vias aéreas hiper-responsivas. A atividade sérica aumentada da arginase também foi quantitativamente relacionada à limitação do fluxo aéreo, medida pelo VEF₁.^28,41

As células epiteliais de pacientes com asma expressam reduzida concentração de L-arginina para níveis aumentados da iNOS e pode conduzir à geração de peroxinitritos e radicais hidroxila, contribuindo para o aumento da contratilidade do músculo liso brônquico, inflamação das vias aéreas, com consequente dano tecidual.

Na resposta asmática tardia o aumento da atividade das arginases pelas citocinas TH2 (IL-4, IL-13) e pelo TGF-ß nas vias aéreas determina uma reduzida disponibilidade de L-arginina para aumento da expressão da iNOS. E a mesma pode começar a gerar ânion superóxido (O_^2-), causando uma deficiência de NO,⁴² ampliando o consumo de NO, pelo aumento da formação de peroxinitrito (ONOO^-), podendo determinar dano pulmonar^42,43 o que pode estar relacionado à obstrução das vias aéreas provocada por alérgenos, à inflamação e hiper-responsividade e à maior sensibilidade aos alérgenos. Além disso, a atividade aumentada da arginase eleva a produção de L-ornitina e seus produtos de síntese, poliaminas e L-prolina, as quais podem ter participação no remodelamento das vias aéreas, através da proliferação celular, intensificando a produção do colágeno e da fibrose, respectivamente (Figura 7).⁴⁴

Através da hibridização in situ para a arginase 1 mRNA, Zimmermann et al.⁴⁰ detectaram pela técnica antissense em pulmões de um modelo experimental de asma, altos níveis de arginase 1 em áreas de inflamação peribrônquica e perivascular. No entanto, em camundongos do grupo controle, não houve expressão detectável da enzima.

Na mesma publicação⁴⁰ os autores apresentam um estudo efetuado em humanos, quando analisaram a expressão da proteína L-arginase 1, no lavado broncoalveolar (Figura 8), em pacientes com asma e em um grupo controle. Obtiveram por imuno-histoquímica um número significativo de células que expressavam a arginase 1 no grupo com asma, principalmente em macrófagos e células mononucleares. A hibridização in situ em biópsias brônquicas destes pacientes detectou intensa  concentração de células arginase 1 mRNA, tendo sido indetectável no grupo controle.

Em um modelo de asma utilizando porquinhos-da-índia, Maarsingh et al.⁴⁵ empregando um potente inibidor específico da arginase por inalação, o ácido 2(S)-amino-6-boronohexanoic (ABH), obtiveram considerável redução da reação asmática precoce e tardia, presumivelmente atenuando a deficiência de substrato induzida por arginase para NOS nas vias aéreas após provocação com alérgeno. Além disso o ABH reduziu a hiper-responsividade brônquica e a inflamação, indicando o potencial que os inibidores das arginases podem apresentar como tratamento na asma alérgica.⁴⁵

O NO atua como broncodilatador ao agir como um neurotransmissor da parcela broncodilatadora do sistema NANC, em oposição aos estímulos colinérgicos broncoconstritores, bem como inibindo a inflamação das vias aéreas e a liberação de mediadores pelos mastócitos. A fim de investigar o papel do NO na inflamação, testes de provocação antigênica têm sido utilizados. A provocação antigênica frequentemente determina em asmáticos respostas precoce, tardia ou ambas, que são demonstradas por queda no VEF₁ e elevação tardia na FeNO.⁴⁶ Pacientes que apresentam resposta precoce ou precoce e tardia quando inalam previamente ao teste de broncoprovocação um potente inibidor de todas as NOS o N^G - nitro-L-arginina metil ester (L-NAME), não apresentam mudanças nos valores basais do VEF₁, deixando, entretanto, de eliminar NO.⁴⁷ Além disso, asmáticos com asma leve que não recebem corticoides, quando se submetem à nebulização com L-NAME e aminoguanidina (um inibidor seletivo da iNOS), demonstram redução na FeNO, embora nenhuma mudança nos sintomas ou no VEF₁ seja detectada.⁴⁸ Estes estudos nos levam a concluir que o NO endógeno não atua de forma expressiva na broncodilatação do paciente asmático. 

Por outro lado, o NO apresenta efeitos supressivos nos linfócitos TH1,⁴⁹ proporcionando possível proliferação de linfócitos TH2 e aumento da produção de IL-4 e IL-5 e consequente inflamação eosinofílica. O NO é capaz de interagir com o ânion superóxido produzindo radicais altamente tóxicos de peroxinitritos (ONOO^- ) que podem contribuir para dano tecidual na asma. O NO bloqueia a apoptose dos eosinófilos mediada via receptor Fas, sugerindo ação pró-inflamatória.

O NO é um potente vasodilatador na circulação brônquica e pode determinar o extravasamento de plasma pelo aumento do fluxo sanguíneo nas vênulas pós-capilares afetadas, determinando aumento da resistência das vias aéreas pela exsudação.

O NO também é produzido como mediador local por macrófagos e neutrófilos ativados, a fim de auxiliar na destruição de microrganismos invasores. Recentemente demonstrou-se uma ação antiviral do NO em células de murídeos e in vivo em ratos. Sanders et al.⁵⁰ demonstraram pela primeira vez que o NO pode inibir a replicação do rinovírus e a produção de citocinas por ele induzidas.⁵¹ Na Figura 9 são apresentados os efeitos do NO nos pulmões.

O NO é um radical livre gasoso, com uma meia-vida extremamente curta, de alguns segundos, rapidamente destruído pela interação como o oxigênio. Na asma o NO é o teste de respiração exalada mais utilizado na prática clínica. Trata-se de um teste útil, prático, confortável, sensível, reprodutível, não-invasivo, que apresenta forte correlação com a inflamação das vias aéreas.

As técnicas e os valores de referência para todas as idades para a medida do NO exalado foram estandardizadas pela European Respiratory Society (ERS) e pela American Thoracic Society (ATS) em 2005.⁵² Em 2011 a ATS publicou um Guideline oficial sobre a interpretação e aplicações clínicas do FeNo.⁵³

Na atualidade os dispositivos para medir a FeNO empregam tecnologia mais moderna que utiliza leitura através de sensor eletroquímico que torna as leituras equivalentes àquelas obtidas com quimioluminescência. Ao contrário da geração anterior os novos aparelhos são mais compactos, portáteis, fáceis de manusear e de manter, mais rápidos e baratos.⁵⁴ (Figura 10).

A técnica tradicional, utilizava a análise por quimiluminescência baseada na medida da intensidade da radiação fluorescente emitida após oxidação química do NO pelo ozônio – NO  +  O₃ –, utilizando um tubo fotomultiplicador sensível. O produto desta reação é o NO₂* +  O₂   (onde * simboliza a luz emitida). O NO₂* emite um fóton e o número total de fótons produzidos é proporcional à concentração de NO.⁵⁵

O teste pelo método de respiração única: (técnica tradicional)

I. Na posição sentada o paciente esvazia os pulmões;

II. Através da peça bucal o paciente inala ar isento de NO, em 2 – 3 segundos, eliminando a possibilidade de qualquer contaminação através do ar ambiente, até o nível da CPT;

III. Sem interrupção, passa então a exalar lentamente através da peça bucal, durante 10 segundos, mantendo o fluxo expiratório constante de 0,05 l .segundo ^-1 (BTPS) através de uma válvula mecânica contendo uma membrana elástica, quando ao final efetua-se a leitura. Uma pressão de 5-20 cm H₂O é gerada durante a exalação, o que fecha o palato, propiciando a exclusão nasal.

IV. O valor daFeNO é calculado pela criação de um platô por no mínimo 3 segundos. Como a exalação ocorre em 10 segundos, o platô situa-se entre 70 a 100% da exalação (entre 7 – 10 segundos) (Figura 11).

Em não fumantes, a fração exalada normal de NO (FeNO₅₀) é < 25 partes por bilhão (ppb) para adultos a 50 ml/seg e em crianças < 20 ppb. Valores maiores que 50 ppb (35 ppb em crianças) são altamente preditivos de inflamação TH2 eosinofílica de vias aéreas e de provável resposta positiva ao tratamento com corticoide por inalação (Tabela 1).

As medidas da FeNO podem ser efetuadas em quase todos os adultos e crianças acima de cinco anos. Níveis menores de FeNO de 30-60%, dependendo do consumo diário, são encontrados em fumantes. Infecções respiratórias elevam a FeNO, como no caso do Rinovírus, que pode oscilar de 50-150%, quando se deve repetir o exame dentro de 14 dias.⁵⁶

Evolutivamente, reduções na FeNO (< 25 ppb em adultos; < 20 em crianças abaixo de 12 anos) podem ter um papel na identificação de pacientes em que se pode reduzir com segurança as doses de corticoide.

A medida da FeNO deve sempre ser efetuada antes da espirometria ou de qualquer atividade física e os examinados devem abster-se, por uma hora, de fumar ou ingerir alimentos ou líquidos. As infecções virais,⁵⁷ a rinite alérgica⁵⁸ e dieta rica em nitrato⁵⁹ podem influenciar os resultados, elevando-os. O tabagismo reduz os valores da FeNO. Fumantes "saudáveis" normalmente têm níveis de FeNO entre 2-10 ppb.⁶⁰ Quando os resultados são elevados, pode significar inflamação eosinofílica, merecendo investigação criteriosa, principalmente se houver história de asma em algum período da vida. A sensibilidade do teste FeNO é alta em pacientes não tratados.⁶¹

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