A contratilidade muscular é definida como a relação instantânea entre força, velocidade, comprimento e tempo.1 A contratilidade exacerbada das células musculares lisas das vias aéreas é uma característica da asma e foi bem demonstrada por Ma et al. através de células isoladas por meio de biópsias endobrônquicas. Aumentos estatisticamente significativos na capacidade máxima de encurtamento foram encontrados em células de músculo liso brônquico de indivíduos com asma em comparação às células normais.2
Na asma ocorrem alterações nas propriedades contráteis do músculo liso das vias aéreas simultaneamente ao aumento em sua massa devido à hipertrofia e/ou hiperplasia, que são presumivelmente os principais responsáveis pelo aumento da responsividade das vias aéreas. Isso as leva a se contraírem mais facilmente em resposta a estímulos, podendo se observar a presença de tônus persistente aumentado da musculatura lisa das vias aéreas nestes pacientes.3-5 É provável que essas alterações ocorram precocemente na história natural da asma.
A contração do músculo liso brônquico decorre da interação de agonistas contráteis como a acetilcolina (Ach), histamina, endotelina-1 (ET-1), prostaglandinas e leucotrienos que determinam a broncoconstrição através de receptores acoplados à proteína G (GPCR). Nas células musculares lisas, a transdução de sinal ocorre quando esses mediadores se ligam a seus receptores específicos na membrana. (Figura 1)
Figura 1 – Regulação da Contração do Músculo Liso
DAG – diacilglicerol; GPCR – receptor acoplado à proteína G; IP3 – trifosfato de inositol; MLC – cadeia leve de miosina; MLCK – quinase de cadeia leve de miosina; MLCP – fosfatase de cadeia leve de miosina; PKC – proteína quinase C; PLC – fosfolipase C; PIP2 – fosfatidilinositol-4,5-bifosfato; ROCK – RHO-associated, Coiled-coil Containing Protein Kinase ou Rho-kinase (Rho quinase; RhoA, família Rho pequena GTPase A); RS – retículo sarcoplasmático. Figura retirada e modificada de Chiba Y et al. J Pharmacol Sci. 2010; 114:239-47.
Quando os GPCRs são ativados por agonistas broncoconstritores, ocorre o acoplamento com uma proteína G heterodimérica (composta por subunidades a, β e γ), promovendo a troca de Difosfato de Guanosina (GDP) por Trifosfato de Guanosina (GTP) na subunidade a. Isso induz à dissociação do complexo, liberando a subunidade Ga ativada, que ativa a enzima fosfolipase C (PLC) (principal via canônica da indução de contração).
✔ O evento desencadeante para qualquer contração muscular é um aumento dos íons cálcio (Ca2+) intracelulares. Após a estimulação pelos agonistas contráteis acontece a abertura dos canais de Ca2+, promovendo a entrada de íons Ca2+, que irão promover a ativação da contração. A origem do cálcio é o líquido extracelular e o retículo sarcoplasmático (RS).
Via 1 — A Ga ativa a fosfolipase C, que hidrolisa o PIP2 (fosfatidilinoditol-4,5-bifosfato) em dois segundos mensageiros:
■ IP3 (inositol trifosfato) → liga-se a receptores IP3R no retículo sarcoplasmático (RS), liberando Ca2+ para o citosol.6-9 O Ca2+ se liga à calmodulina (CaM), uma proteína mensageira ligadora de cálcio, e o aumento do Ca2+ forma o complexo homo tetramétrico constituído por quatro subunidades, cada uma com peso molecular de 260 kDa.10
■ DAG (diacilglicerol) → permanece na membrana e ativa a proteína quinase C (PKC).
O complexo 4Ca2+– calmodulina – miosina quinase de cadeia leve (MLCK) em contrapartida abre e ativa o domínio enzimático da MLCK.8 A atividade da quinase de cadeia leve de miosina (MLCK) é controlada pela elevação na concentração do Ca2+ citosólico proveniente do influxo de cálcio extracelular dos reservatórios do RS.
A capacidade contrátil das células musculares lisas presentes nas vias aéreas é primordialmente influenciada pela fosforilação da cadeia leve de miosina (MLC) – "fosforilar" significa adicionar um grupo fosfato. Essa fosforilação é o evento-chave para iniciar o ciclo da ponte cruzada de actina-miosina e assim a contração. O nível de fosforilação da MLC é meticulosamente controlado por meio da ação de duas enzimas determinantes: a cadeia leve de miosina quinase (MLCK) e a fosfatase de cadeia leve de miosina (MLCP).6
O aumento do Ca2+ intracelular é o evento central que desencadeia a cascata de contração através da via Ca2+/calmodulina → MLCK → fosforilação da MLC. Como as fibras musculares lisas são extremamente pequenas, esses íons Ca2+ podem difundir-se para todas as partes do músculo liso, promovendo a contração. O tempo necessário para que ocorra essa difusão é de 200 a 300 ms. |
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A MLCK se liga às moléculas de MLC nas fibras de miosina dentro da célula muscular lisa. Inicia-se a transferência de grupos fosfato de ATP (trifosfato de adenosina) para a MLC. Isso resulta na fosforilação da MLC – resíduo de aminoácido específico (serina 19) da subunidade reguladora da cadeia leve de 20 kDa de miosina – MLC20 que é uma modificação química importante.
A fosforilação promove a formação de pontes cruzadas com o filamento de actina e sofre transformações moleculares cíclicas, permitindo que os filamentos de miosina se liguem aos filamentos de actina encurtando11 a célula muscular lisa, resultando na sua contração.6-8,12 A subunidade ligada à miosina, quando fosforilada, inibe a atividade enzimática da MLCP, permitindo que a MLC20 se mantenha fosforilada, promovendo assim a contração do músculo liso.6,7,13,14 (Figura 1)
No entanto, duas outras vias podem inibir essa desfosforilação:
Como descrito até aqui, no músculo liso, a contração depende portanto da Cadeia Leve da Miosina (MLC)
■ MLC fosforilada = Músculo contraído.
■ MLC desfosforilada = Músculo relaxado.
Quem controla isso são duas enzimas opostas:
A força do músculo liso das vias aéreas é controlada principalmente pela fosforilação da cadeia leve da miosina. Esse processo depende do equilíbrio entre a MLCK que fosforila a miosina e a MLCP que remove essa fosforilação.
■ MLCK (quinase) = coloca fosfato na MLC → CONTRAI
■ MLCP (fosfatase) = tira fosfato da MLC → RELAXA
Via 2 — Quando o agonista ativa a PLC, ela cliva por hidrólise o fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (PIP2) gerando o diacilglicerol (DAG). O DAG ativa a PKC. A PKC, então fosforila a proteína quinase C de 17 kDA chamada (CPI-17). Essa CPI-17 fosforilada age como uma "tampa" que se encaixa na MLCP e a bloqueia fisicamente. Com a MLCP reprimida, a MLC não consegue ser desfosforilada, viabilizando a contração.6-15
Via 3 — Agonistas (como endotelina-1) ativam receptores acoplados à proteína G (Gα12/13), que recrutam a RhoA. A RhoA ativa a Rho-quinase. A Rho-quinase atua fosforilando a subunidade regulatória da MLCP chamada Myosin Phosphatase Target Subunit-1 (MYPT1). Em particular, a fosforilação de MYPT1 nos resíduos Thr696 e Thr853 (ambos em humanos) medeia a inibição da atividade de MLCP, impedindo o relaxamnto do músculo liso das vias aéreas. Essa fosforilação inibitória promove o estado fosforilado da MLC, consequentemente promovendo a contração do músculo liso.15-18
A Rho-quinase atua fosforilando a subunidade M regulatória da MLCP, gerando em consequência contração do músculo liso. |
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Ambas as vias têm o mesmo objetivo final (inibir a MLCP), mas "operam instrumentos" diferentes (CPI-17 vs MYPT1) e são acionadas por distintos estímulos. Por isso são chamadas de vias de sensibilização ao Ca2+: mesmo que uma falhe a outra ainda pode manter a contração sustentada. Elas garantem que, mesmo com a concentração de cálcio voltando ao normal, o músculo não relaxe imediatamente.
A via de sensibilização ao Ca2+ leva à contração máxima sem levar em conta a concentração intracelular de Ca2+, pela regulação do estado de fosforilação da MLC pela MLCP.9
➭Como resultado de um processo de homeostase, o aumento nos níveis citosólicos livres de Ca2+ é então rápido e praticamente revertido por uma recaptura no retículo sarcoplasmático/endoplasmático, basicamente mediada pela ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático (SERCA2b), que reabastece assim as reservas intracelulares de Ca2+ previamente esgotadas.14 Esse processo de transporte de cálcio pelo SERCA2b é fundamental para regular a concentração de cálcio no citoplasma, permitindo que as células musculares relaxem após a contração, controlando a liberação de cálcio durante a contração muscular e desempenhando papel importante em muitos outros processos celulares, como a sinalização celular e a homeostase de cálcio. A energia fornecida pela hidrólise do ATP é essencial para impulsionar esse processo contra um gradiente de concentração.
A remoção do Ca2+ do citosol através de processo energético dependente de ATP, mediado pela bomba SERCA2b (recaptura) viabiliza o relaxamento e o término da contração.
Liberação de energia: A hidrólise do ATP → ADP + Pi libera ~30,5 kJ/mol, que é utilizada para transportar Ca2+.
Modificações na função ou expressão SERCA2b estão envolvidas na fisiopatologia da asma em relação ao tônus do músculo liso peribrônquico, contribuindo para o relaxamento dificultado e agravando a hiper-responsividade das vias aéreas (HVA). Na Figura 2 visualiza-se o fluxograma contração x relaxamento.
Figura 2 – Fluxograma Integrado – Contração X Relaxamento (Normal)
O término da contração e o relaxamento do músculo liso são possibilitados principalmente pela remoção do Ca2+ citosólico, um processo energético (dependente de ATP) mediado pela bomba SERCA2b no retículo sarcoplasmático.
Alterações na função ou expressão do SERCA2b estão implicadas na fisiopatologia da asma, contribuindo para o relaxamento prejudicado e a HRB. Na asma ocorre uma expressão diminuída do SERCA2b no músculo liso das vias aéreas com importantes repercussões:19,20
O que Acontece na Asma: Diminuição da Expressão/Atividade da SERCA2b
Na asma, especialmente na asma grave, impulsionada por citocinas IL-4, IL-5 e IL-13, ocorre inibição de função e expressão da SERCA2b (bomba de Ca2+ + ATPase do RS/Endoplasmático) no músculo liso das vias aéreas.21,22 Esse bloqueio está associado à inflamação crônica,20 ao estresse oxidativo e às alterações epigenéticas como p. ex. a hipometilação de histonas em genes pró-contráteis e repressão da SERCA; decorrendo como consequências imediatas uma recaptação pouco eficiente do Ca2+ citosólico após a contração com precário reabastecimento do retículo sarcoplasmático. Como consequência o estoque interno de cálcio entra em declínio.
O RS é um sinal de crise para a célula muscular lisa que possui sensores de Ca2+ – principalmente a molécula de interação estromal 1 (STIM1)
que monitora os níveis de cálcio e ativa a entrada de cálcio do meio externo para o interior da célula sempre que se esgotam os estoques. Quando os níveis de cálcio do RS diminuem a proteína STIM detecta essa queda,
sofre uma mudança conformacional e migra para regiões próximas à membrana plasmática. Estabelece acoplamento físico e funcional com os canais Orai1, induzindo sua abertura e permitindo um influxo altamente seletivo de Ca2+.
Além disso, a STIM1 pode modular subtipos específicos de canais da família TRPC, os quais atuam como vias catiônicas adicionais que ampliam a corrente de entrada de Ca2+ contribuindo para a restauração eficiente dos estoques intracelulares.23-25
O processo global é denominado entrada de cálcio operada por depleção de reservas (Store-Operated Calcium Entry – SOCE) um mecanismo fundamental para a homeostase de Ca2+ e para a sustentação de sinais cálcio dependentes de longa duração.
Por que Isso Sustenta Um Estado de Hiperexcitabilidade?
Mesmo com inibição SERCA a ativação contínua da SOCE promove entrada mantida (sustentada) e crônica de Ca2+ do meio extracelular para o citosol do miócito — mais cálcio disponível para o complexo actina-miosina significa contrações mais potentes, rápidas e difíceis de relaxar (hiper-reponsividade das vias aéreas). Por outro lado o cálcio permanentemente elevado ativa vias de transcrição gênica que por sua vez estimulam a proliferação (hiperplasia) e o aumento do tamanho (hipertrofia) das células musculares lisas, que contribuem para o exagerado estreitamento da luz brônquica, além de secretar mais matriz extracelular – o que fundamenta o remodelamento.
Figura 3 – Inibição da Expressão SERCA na Asma – Hiperexcitabilidade
Resumindo:
Na asma, a redução do SERCA2b impede o reabastecimento do retículo sarcoplasmático, e a célula interpreta esse “RS esvaziado” como um sinal para abrir canais de entrada de Ca2+ na membrana, causando elevação sustentada de Ca2+ citosólico, determinando aumento da sensibilidade contrátil e da excitabilidade das células musculares lisas das vias aéreas, favorecendo a persistente broncoconstrição e a hiper-responsividade brônquica. |
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