A contratilidade exacerbada das células musculares lisas das vias aéreas de asmáticos é uma característica da asma e foi bem demonstrada por Ma et al. através de células isoladas por meio de biópsias endobrônquicas. Aumentos estatisticamente significativos na capacidade máxima de encurtamento foram encontrados em células de músculo liso brônquico de indivíduos com asma em comparação às células normais.¹

A contração do músculo liso brônquico decorre da interação de inúmeros agonistas que determinam a broncoconstrição através de seus receptores acoplados à proteína G (GPCR), sendo a contração mediada por vias de sinalização intracelulares complexas, dentre elas:^2-4 (Figura 1)

 

Figura 1 – Regulação da Contração do Músculo Liso

DAG, diacilglicerol; GPCR, receptores acoplados à proteína G; IP3, trifosfato de inositol; MLC, cadeia leve de miosina; MLCK, quinase de cadeia leve de miosina; MLCP, fosfatase de cadeia leve de miosina; PKC, proteína quinase C; PLC, fosfolipase C; PIP2, fosfatidilinositol-4,5-bifosfato; ROCK, RHO-associated, Coiled-coil Containing Protein Kinase ou Rho-kinase (Rho quinase; RhoA, família Rho pequena GTPase A); RS, retículo sarcoplasmático. Figura retirada e modificada de Chiba Y et al. J Pharmacol Sci. 2010; 114:239-47.

1 – Após o acoplamento a ativação do receptor pelos agonistas causa alterações conformacionais do receptor, resultando na dissociação das proteínas G heterotriméricas associadas ao receptor e das subunidades Gα das subunidades Gβ e Gγ. Posteriormente, as subunidades Gα (Gαq 11, Gα12 e/ou Gα13) destas proteínas G ativam a fosfolipase C (PLC). A PLC hidrolisa o fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (PIP2) resultando na geração de dois segundos mensageiros – o inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e o diacilglicerol (DAG). O IP3 se liga aos seus receptores IP3R que controlam muitos processos celulares, gerando sinais internos de cálcio no retículo sarcoplasmático (RS), iniciando sua liberação do RS para o citoplasma.^2,5 A liberação de Ca²⁺ ocorre de modo oscilatório e se propaga ao longo da célula na forma de uma onda de Ca²⁺. O Ca²⁺ se liga à calmodulina (CaM), uma proteína reguladora, e o aumento do Ca²⁺ citosólico forma o complexo homotetramétrico constituído por quatro subunidades, cada uma com peso molecular de cerca de 260 kDa.⁶ O complexo 4Ca²⁺– calmodulina – miosina quinase de cadeia leve (MLCK) em contrapartida abre e ativa o domínio enzimático da MLCK.⁴ A atividade da quinase de cadeia leve de miosina (MLCK) é controlada pela elevação na concentração do Ca²⁺ citosólico proveniente do influxo de cálcio extracelular dos reservatórios do RS.

A capacidade contrátil das células musculares lisas presentes nas vias aéreas é primordialmente influenciada pela fosforilação da cadeia leve de miosina (MLC). Essa fosforilação é o evento-chave que desencadeia a ativação do mecanismo contrátil. O nível de fosforilação da MLC é meticulosamente controlado por meio da ação de duas enzimas cruciais: a cadeia leve de miosina quinase (MLCK) e a fosfatase de cadeia leve de miosina (MLCP).²

A MLCK se liga às moléculas de MLC nas fibras de miosina dentro da célula muscular lisa. Inicia-se a transferência de grupos fosfato de ATP (trifosfato de adenosina) para a MLC. Isso resulta na fosforilação da MLC – resíduo de aminoácido específico (serina 19) da subunidade reguladora da cadeia leve de 20 kDa de miosina – que é uma modificação química importante. A fosforilação promove a formação de pontes cruzadas com o filamento de actina e sofre transformações moleculares cíclicas, permitindo que os filamentos de miosina se liguem aos filamentos de actina encurtando⁷ a célula muscular lisa, resultando na sua contração.^2-4,8 A subunidade ligada à miosina, quando fosforilada, inibe a atividade enzimática da MLCP, permitindo que a MLC se mantenha fosforilada, promovendo assim a contração do músculo liso.^2,3,9,10 (Figura 1)

Como resultado de um processo de homeostase, o aumento nos níveis citosólicos livres de Ca²⁺ é então rápido e praticamente revertido por uma recaptura no retículo sarcoplasmático/endoplasmático, basicamente mediada pela ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático (SERCA), que reabastece assim as reservas intracelulares de Ca²⁺ previamente esgotadas.¹⁰ Esse processo de transporte de cálcio pelo SERCA é fundamental para regular a concentração de cálcio no citoplasma, permitindo que as células musculares relaxem após a contração, controlando a liberação de cálcio durante a contração muscular e desempenhando papel importante em muitos outros processos celulares, como a sinalização celular e a homeostase de cálcio. A energia fornecida pela hidrólise do ATP é essencial para impulsionar esse processo.

2 – A ativação do receptor acoplado à proteína G (GPCR) leva conjuntamente à elevação de RhoA e Rho quinase (ROCK), o que também conduz à subsequente inibição da MLCP.^2,3,11 A MLCP é uma serina (Ser)-treonina (Thr) fosfatase expressa no músculo liso cuja função é independente dos níveis de Ca²⁺. A MLCP é a enzima responsável pela desfosforilação da MLC. Portanto, a ação da MLCP, que remove os grupos fosfato da MLC, ➢ relaxa o músculo liso. A MLCP é uma enzima complexa composta por várias subunidades. As principais subunidades incluem a catalítica PP1c (Proteína Fosfatase 1 catalítica), as regulatórias Myosin Phosphatase Target Subunit 1(MYPT1) e MYPT2 e outras subunidades acessórias.¹² A atividade da MLCP é regulada por meio da fosforilação de sua subunidade MYPT1.

A Rho-quinase atua fosforilando a subunidade regulatória (ou subunidade M) da MLCP, a MYPT1. Em particular, a fosforilação de MYPT1 nos resíduos Ser⁵⁰⁷, Thr^853/850 e Thr^696/695 medeia a inibição da atividade de MLCP e, portanto, a inibição do relaxamento do músculo liso das vias aéreas.¹³ Além disso, a fosforilação do MYPT1 em Ser⁹⁶⁵, Ser⁶⁹⁶ e Ser⁸⁵² também é observada no músculo liso das vias aéreas. Essa fosforilação inibindo a MLCP promove assim o estado fosforilado da MLC⁴ e, consequentemente, a contração do músculo liso. – é a sensibilização ao Ca²⁺. (Figura 1) A via de sensibilização ao Ca²⁺ leva à contração máxima sem levar em conta a concentração intracelular de Ca²⁺, pela regulação do estado de fosforilação da MLC pela MLCP.⁵

3 – A ativação da proteína quinase C (PKC) pelo diacilglicerol (DAG) leva à fosforilação da proteína inibidora da fosfatase potencializada pela proteína quinase C de 17 kDa (CPI-17), que se liga à subunidade catalítica da MLCP, e desativa a MLCP,^2,14 impedindo a desfosforilação da MLC — outra via da sensibilização ao Ca²⁺.

➭ Além do IP3, a liberação de Ca²⁺ do SR também é estimulada pela ativação do CD38 induzida por agonistas, produzindo ADP-ribose cíclica (ADPRc) que, presumivelmente, interage com receptores de rianodina (RyR). Com base nos dados acumulados na literatura, parece que a sinalização CD38/cADPR é uma via comum de regulação do cálcio intracelular para uma variedade de agonistas.

CD38 é uma glicoproteína monomérica, de 46 kDa, tipo II, com cauda citoplasmática curta no terminal NH2 e em uma única região que atravessa a membrana e um longo domínio catalítico extracelular no terminal COOH.¹⁵ É uma proteína bifuncional e possui atividades de ADP-ribosil ciclase e cADPR hidrolase.^16,17 Nas células musculares lisas das vias aéreas, o CD38 está associado à membrana plasmática. ADP-ribosil ciclase converte ß-NAD em cADPR. cADPR é convertido em ADPR pela hidrolase cADPR. (Figura 2)

 

Estudos em células musculares lisas forneceram evidências de que a liberação de cálcio através dos canais do receptor de rianodina (RyR) é sensibilizada não apenas pelo cálcio, mas também pelo cADPR.^18,19 A atividade mobilizadora de cálcio do cADPR contribui para respostas de cálcio intracelular induzidas por agonistas no músculo liso das vias aéreas. CD38 é a principal fonte de síntese de cADPR no músculo liso das vias aéreas. O mecanismo pelo qual a estimulação do receptor acoplado à proteína G provoca a ativação do CD38 e a produção de cADPR não está perfeitamente compreendida, assim como o processo pelo qual o cADPR, gerado extracelularmente, entra na célula para provocar a liberação de cálcio intracelular.²⁰

Além disso, esta via reguladora do cálcio contribui para alterações na homeostase do cálcio brônquico induzidas por citocinas inflamatórias e TH2, sugerindo um papel na patogênese da hiper-responsividade brônquica.

➭ A GTPase Rac1 monomérica não desempenha um papel direto na contração das células musculares lisas das vias aéreas. Atua também em funções celulares importantes no citoesqueleto, na montagem correta da actina, como formação de lamelipódios, motilidade e migração que incluem células musculares lisas.²¹ Entretanto, a ativação de Rac1 é responsável pelo aumento induzido por broncoconstritor no Ca²⁺ intracelular, concentração e contração tanto em células musculares lisas brônquicas murinas quanto humanas, através de sua associação com PLC e estimulação da produção de IP3. A relevância desta via de sinalização em células de músculo liso de vias aéreas foi destacada ao demonstrar que Rac1 era superativado em células de músculo liso de vias aéreas de pacientes asmáticos, bem como em células de músculo liso de vias aéreas de camundongos desenvolvendo asma alérgica.²²

01.Ma X, Cheng Z, Kong H, et al. Changes in biophysical and biochemical properties of single bronchial smooth muscle cells from asthmatic subjects. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2002; 283:L1181–9.

02.Hassoun D, Rose L, Blanc FX, Magnan A, Loirand G, Sauzeau V. Bronchial smooth muscle cell in asthma: where does it fit? BMJ Open Respir Res 2022; 9:e001351.

03.Delmotte P, Ressmeyer AR, Bai Y, Sanderson MJ. Mechanisms of airway smooth muscle relaxation induced by beta2-adrenergic agonists. Front Biosci (Landmark Ed). 2010; 15:750-64.

04.Chiba Y, Matsusue K, Misawa M. RhoA, a possible target for treatment of airway hyperresponsiveness in bronchial asthma. J Pharmacol Sci 2010; 114:239-47.

05.Berridge MJ. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature 1993; 361:315-25.

06.Patel S, Joseph SK, Thomas AP. Molecular properties of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. Cell Calcium 1999; 25:247-64.

07.Sanderson MJ, Delmotte P, Bai Y, Perez-Zogbhi JF. Regulation of airway smooth muscle cell contractility by Ca2+ signaling and sensitivity. Proc Am Thorac Soc 2008; 5:23-31.

08.Jude JA, Wylam ME, Walseth TF, Kannan MS. Calcium signaling in airway smooth muscle. Proc Am Thorac Soc 2008; 5:15-22.

09.Bossé Y, Sobieszek A, Paré PD, Seow CY. Length adaptation of airway smooth muscle. Proc Am Thorac Soc 2008; 5:62-7.

10.Pelaia G, Renda T, Gallelli L, Vatrella A, Busceti MT, Agati S, Caputi M, Cazzola M, Maselli R, Marsico SA. Molecular mechanisms underlying airway smooth muscle contraction and proliferation: implications for asthma. Respir Med 2008; 102:1173-81.

11.Swärd K, Mita M, Wilson DP, Deng JT, Susnjar M, Walsh MP. The role of RhoA and Rho-associated kinase in vascular smooth muscle contraction. Curr Hypertens Rep 2003; 5:66-72.

12.Álvarez-Santos MD, Álvarez-González M, Estrada-Soto S, Bazán-Perkins B. Regulation of Myosin Light-Chain Phosphatase Activity to Generate Airway Smooth Muscle Hypercontractility. Front Physiol 2020; 11:701.

13.Chen CP, Chen X, Qiao YN, Wang P, He WQ, Zhang CH, Zhao W, Gao YQ, Chen C, Tao T, Sun J, Wang Y, Gao N, Kamm KE, Stull JT, Zhu MS. In vivo roles for myosin phosphatase targeting subunit-1 phosphorylation sites T694 and T852 in bladder smooth muscle contraction. J Physiol 2015; 593:681-700.

14.Sakai H, Hirano T, Takeyama H, Chiba Y, Misawa M. Acetylcholine-induced phosphorylation of CPI-17 in rat bronchial smooth muscle: the roles of Rho-kinase and protein kinase C. Can J Physiol Pharmacol 2005; 83:375-81.

15.Sun L, Adebanjo OA, Moonga BS, Corisdeo S, Anandatheerthavarada HK, Biswas G, Arakawa T, Hakeda Y, Koval A, Sodam B, Bevis PJ, Moser AJ, Lai FA, Epstein S, Troen BR, Kumegawa M, Zaidi M. CD38/ADP-ribosyl cyclase: A new role in the regulation of osteoclastic bone resorption. J Cell Biol 1999; 146:1161-72.

16.Lee HC, Galione A, Walseth TF. Cyclic ADP-ribosemetabolism and calcium mobilization function. Vit Horm 1994; 48:199–258.

17.De Flora A, Franco L, Guida L, Bruzzone S, Zocchi E. Ectocellular CD38–catalyzed synthesis and intracellular Ca(2+)-mobilizing activity of cyclic ADP-ribose. Cell Biochem Biophys 1998; 28:45–62.

18.Kuemmerle JF and Makhlouf GM. Agonist-stimulated cyclic ADP ribose. Endogenous modulator of Ca2-induced Ca2 release in intestinal longitudinal muscle. J Biol Chem 1995; 270: 25488–25494.

19.Wang YX, Zheng YM, Mei QB, Wang QS, Collier ML, Fleischer S, Xin HB, and Kotlikoff MI. FKBP12.6 and cADPR regulation of Ca2 release in smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol 2004; 286:C538–C546.

20.Deshpande DA, Walseth TF, Panettieri RA, Kannan MS. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. FASEB J 2003; 17:452-4. 

21.Li B, Wang R, Wang Y, Stief CG, Hennenberg M. Regulation of smooth muscle contraction by monomeric non-RhoA GTPases. Br J Pharmacol 2020; 177:3865-3877.

22.André-Grégoire G, Dilasser F, Chesné J, Braza F, Magnan A, Loirand G, Sauzeau V. Targeting of Rac1 prevents bronchoconstriction and airway hyperresponsiveness. J Allergy Clin Immunol 2018; 142:824-833.e3.