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Asma Brônquica

Resposta Tardia da Asma

Eosinófilos

A eosinofilia é um marcador de asma grave e de pacientes em risco de exacerbações mais frequentes

Os eosinófilos foram observados pela primeira vez por Thomas Wharton Jones em 1846. Paul Ehrlich em 1879 publicou a técnica de coloração de células sanguíneas e seu método de contagem diferencial, utilizando corantes. Mencionava o eosinófilo que se corava intensamente pela eosina, um corante acidófilo produzido pela ação do bromo na fluoresceína, corando as proteínas básicas. Ele especulou corretamente que o conteúdo de 'alfa-grânulos' eram produtos secretores e descreveu várias causas de eosinofilia, incluindo a asma, várias doenças de pele, helmintíases e reações a medicamentos.1

A eosinofilia sanguínea maior que 4% ou 300-400 / µL suporta o diagnóstico de asma, mas a ausência desse achado não é excludente. Contagens de eosinófilos superiores a 8% podem ser observadas em pacientes com dermatite atópica concomitante. Esse achado deve levar em conta também uma pesquisa para pneumonia eosinofílica, aspergilose broncopulmonar alérgica ou síndrome de Churg-Strauss. Os eosinófilos estão presentes por apenas algumas horas no sangue,2 mas podem sobreviver nos tecidos por várias semanas.3

Os eosinófilos são as células efetoras biológicas que geram a inflamação e a hiper-responsividade das vias aéreas em aproximadamente 50% dos pacientes com asma, levando a exacerbações frequentes, comprometimento da função pulmonar e redução da qualidade de vida.

A célula numericamente predominante na inflamação inicial e tardia da asma é o eosinófilo (Figura 1).  A associação entre eosinófilo e doenças alérgicas já é conhecida há longa data, embora até 1980 acreditava-se que estas células tivessem ação anti-inflamatória. Este falso conceito mudou após o reconhecimento da alta toxicidade das proteínas contidas nos grânulos dos eosinófilos, para os helmintos, células de mamíferos e para as células epiteliais do trato respiratório. Na atualidade os eosinófilos são considerados células pró-inflamatórias que medeiam as manifestações das doenças alérgicas, incluindo-se a asma.

Estas células contribuem ativamente para cascatas inflamatórias inatas e adaptativas por meio da produção e liberação de diversas quimiocinas, citocinas, mediadores lipídicos e outros fatores de crescimento cujos mRNAs e proteínas já foram totalmente identificados.

IL-3, IL-5 e GM-CSF produzem maior diferenciação eosinofílica, prolongam sua sobrevida, favorecem sua adesão, quimiotaxia e ativação, determinando uma autoperpetuação da infiltração inflamatória eosinofílica. Como os mastócitos, os eosinófilos secretam mediadores lipídicos PAF, LTC4, 15-HETE, prostaglandinas (PGE1, PGE2) e tromboxane B2. Níveis elevados de IL-3 e / ou IL-5 são observados com mais frequência na eosinofilia associada a respostas alérgicas e asma.4 Por outro lado, níveis elevados de GM-CSF indicam mais tipicamente a presença de malignidade.5

Os eosinófilos são granulócitos formados na medula óssea, sendo a célula precursora a mesma dos basófilos e já no início de seu desenvolvimento também expressam o antígeno CD34+. Estas células CD34+ (células progenitoras pluripotentes) inicialmente sob ação da IL-3, IL-5 e GM-CSF vão se diferenciando. A IL-5 é importante na estimulação da eosinofilopoese; regula a expressão isoforma transmembrana de seu próprio receptor; promove a diferenciação final dos precursores mieloides em eosinófilos e a sua maturação que dura aproximadamente cinco dias (Tabela1).6 Após deixar a medula óssea, os eosinófilos circulam brevemente (meia-vida de 3 a 8 horas) na corrente sanguínea, e então migram para vários tecidos.

Tabela 1 - Diferenciação do Eosinófilo

Diferenciação Eosinófilo

Mieloblasto
Promielócito I
Promielócito II
Mielócito
Metamielócito
Eosinófilo Maduro
Desenvolvimento
Tamanho (mm)
16 mm
20 mm
16-18 mm
 
16,5 -17 mm

O eosinófilo humano típico apresenta de 12 a 17 micrômetros de diâmetro, com um núcleo bilobado, sem nucléolo, ocupado parcialmente por cromatina, mitocôndrias, microtubos, corpúsculos lipídicos (principal depósito de ácido araquidônico), retículo endoplasmático, aparelho de Golgi e grânulos citoplasmáticos intactos. Estes grânulos, três ou quatro tipos, são identificados por microscopia eletrônica:

a) grandes, densos, esféricos, também chamados de “específicos” ou “secundários”, possuem à microscopia eletrônica um núcleo central cristalino-denso, circundado por substância menos densa. O núcleo cristalino é constituído pela proteína básica maior (MBP), enquanto que a matriz é constituída pela proteína catiônica eosinofílica (ECP), peroxidase eosinofílica (EPO), proteína X eosinofílica (EPX) e neurotoxina derivada do eosinófilo (EDN) (Figura 2). Estas quatro proteínas têm avidez por corantes ácidos como a eosina, advindo daí o nome eosinófilo;

b) grandes e médios no tamanho, densos, esféricos, sem núcleo cristalino denso, também chamados de grânulos “primários” os quais contêm outra proteína chamada lisofosfolipase que forma os chamados cristais bipiramidais hexagonais de Charcot-Leyden encontrados no escarro de asmáticos;

c) grânulos pequenos e densos “pequenos grânulos”;

d) o retículo endoplasmático, o aparelho de Golgi a as mitocondrias desempenham uma função central na biossíntese de proteínas e de trifosfato de adenosina no eosinófilo;

e) os corpúsculos lipídicos têm importância na produção de eicosanoides, incluindo leucotrienos, prostaglandinas e tromboxane.7 Os corpúsculos lipídicos são importantes para a esterificação do ácido araquidônico e produção de eicosanoides em consequência de suas elevadas concentrações de importantes enzimas, tais como a 5-lipoxigenase, ciclooxigenase e leucotrieno C4-sintase.8

Pacientes com doenças que cursam com eosinofilia, como a asma, possuem duas populações de eosinófilos no sangue periférico que podem ser distinguidas de acordo com a sua densidade em “normodensos” e “hipodensos”. Em indivíduos normais 90% dos eosinófilos são do tipo normodenso. Na asma o percentual médio de eosinófilos hipodensos varia entre 35 e 65%, enquanto que em outras síndromes hipereosinofílicas este valor pode ser superior a 80%.1 No sangue de pacientes com asma, os eosinófilos hipodensos secretam maior quantidade de LTC4 do que os normodensos.9 O teste de provocação brônquica com antígenos aumenta o percentual de eosinófilos hipodensos no sangue periférico de pacientes com asma, tanto na resposta imediata como na tardia.10

Os mecanismos de síntese e diferenciação quanto à densidade dos eosinófilos ainda não são conhecidos. Várias hipóteses para explicar a significação do eosinófilo hipodenso foram propostas: 1) células mais maduras e metabolicamente mais ativas que os normodensos, com consumo aumentado de oxigênio e capacidade aumentada de gerar ânion superóxido; 2) uma célula imatura; 3) uma linhagem distinta de eosinófilos; 4) uma combinação das três possibilidades prévias. Os dados disponíveis até o momento favorecem a primeira hipótese.

Para cada eosinófilo na circulação existem de 100 a 300 eosinófilos nos tecidos. São distribuídos em vários órgãos, pele, glândulas mamárias, útero, vagina e preferencialmente em tecidos com interface aérea, como tubo gastrintestinal, e trato respiratório. A IL-5 aumenta a permanência dos eosinófilos no sangue periférico, a sua  adesão às células endoteliais vasculares, promove a migração dos eosinófilos do sangue para os tecidos, aumenta a sobrevida (longevidade) nos tecidos e sua atividade citotóxica.

Dados sugerem diferentes subpopulações heterogêneas de eosinófilos in vivo em função do microambiente, podendo diferir na expressão de receptores de superfície e citocinas a sua resposta à patologia (alérgica, parasitária, neoplásica, imune).11-13

Os eosinófilos também possuem receptores FceRI, porém nestas células são quase que de localização inteiramente intracelular. Ainda não foi esclarecido se estes receptores apresentam alguma função na mediação da degranulação nas doenças alérgicas.

A fisiopatologia dos eosinófilos na inflamação das vias aéreas depende de interações específicas celulares com o estímulo, citocinas e agentes exógenos. O rápido avanço nos conhecimentos da estrutura celular e da biologia molecular do eosinófilo começa a elucidar as várias vias da sinalização transmembrana que transmitem informações de fora para o interior da célula através da interação agonista-receptor. Acredita-se que a participação do eosinófilo na inflamação seja regulada por múltiplos mediadores no próprio local da reação inflamatória. A participação funcional dos eosinófilos pode ser iniciada por interações entre a superfície celular com ligantes particulados e solúveis. A união destes agonistas com os receptores específicos de superfície dos eosinófilos inicia uma cascata de sinais transmembrana que resultam na ativação do eosinófilo, incluindo a exocitose dos grânulos e geração de metabólitos do oxigênio. Como os neutrófilos, os eosinófilos apresentam múltiplas vias de sinalização para sua ativação funcional. Interações ligante-receptor podem ativar as proteínas G, a adenilciclase, o metabolismo fosfolipídico, a fosforilação proteica (serina/treonina ou tirosina), os fluxos [Ca 2+ ], os fatores de transcrição nuclear e as mudanças de pH nos eosinófilos. Múltiplas vias são frequentemente ativadas por uma única interação receptor-ligante.

Os grânulos específicos secundários quando ativados liberam proteínas que são citotóxicas e importantes no mecanismo do dano tecidual. Análises por microscopia eletrônica evidenciam ruptura da membrana plasmática com extravasamento do conteúdo citoplasmático.14-18 A MBP responde por 50% das proteínas dos grânulos secundários. Em baixas doses a MBP causa esfoliação de células epiteliais e distúrbios na função ciliar por perda da ATPase axonemal e mudanças na secreção de água e cloretos.14 Em altas concentrações, tem alta capacidade destrutiva do epitélio expondo a camada basal. Através da técnica de imunofluorescência constata-se a deposição de MBP nos locais de dano epitelial.16 A MBP causa contração da musculatura lisa peribrônquica, aumenta a hiper-responsividade brônquica e reduz a atividade e frequência dos batimentos ciliares. Existem evidências de que seletivamente bloqueie os receptores colinérgicos subtipo M2 nas terminações nervosas das vias aéreas, diminuindo a liberação de acetilcolina. A MBP através deste bloqueio, pode aumentar a broncoconstrição mediada pelo vago, contribuindo para aumentar ainda a sensibilidade colinérgica na asma.19 A MBP pode estimular a liberação de histamina e leucotrieno C4 de basófilos humanos e pode ativar mastócitos.

A ECP tem ação semelhante à MBP, enquanto que a EPO, em baixas concentrações, causa cilioestase e esfoliação epitelial. A ECP demonstrou ser 8 a 10 vezes mais potente do que MBP.20 Estudos têm demonstrado que MBP, ECP e EPO induzem a uma estimulação não citolítica da histamina tanto em basófilos como em mastócitos. Como dado adicional é mencionada a atividade ribonuclease que têm ECP e EDN.21,22

Os cristais de Charcot-Leyden (galectina-10) (CCL) produzidos nos grânulos primários são cristais hexagonais bipiramidais que possuem atividade lisofosfolipase, sendo encontrados em associação com eosinofilia de fluidos orgânicos ou tecidos (Figura 3). O papel da lisofosfolipase ainda não foi esclarecido, porém parece proteger as células dos efeitos líticos dos lisofosfolipídios gerados no sítio da inflamação. Podem também destruir o surfactante e alterar as propriedades de tensão de superfície, favorecendo atelectasias. Em tecidos caracterizados por infiltração eosinofílica, cristais de Charcot-Leyden são frequentemente encontrados no espaço extracelular, sugerindo uma liberação de eosinófilos ativados ou citolíticos.23 Os cristais de Charcot-Leyden estimulam as respostas imunes de TH2, enquanto que uma forma mutante solúvel é considerada inerte.24

O principal metabólito do ácido araquidônico nos eosinófilos é o leucotrieno LTC4 (ácido 5[S]-hidroxi-6[R]-glutationil-7,9- trans -11,14- cis -eicosatetraenoico). O LTC4, através de um transporte transmembrana específico,25,26 deixa o eosinófilo e, no espaço extracelular, serve como substrato para a glutamil transpeptidase, que fragmenta o ácido glutâmico pela metade, por clivagem em sua cadeia peptídica, para formar o LTD4 (ácido 5[S]-hidroxi-6[R]-cisteinil-glicil-7,9 trans- 11,14- cis- eicosatetraenoico). O LTD4 é processado pela remoção da metade glicina da cadeia peptídica para formar o LTE4 (ácido 5[S]-hidroxi-6[R]-cisteinil-7,9- trans -11,14- cis -eicosatetraenoico).

Os eosinófilos produzem uma grande quantidade de LTC4 e uma pequena de LTB4, ao contrário dos neutrófilos, que produzem grandes quantidades de LTB4 e pequenas quantidades de LTC4. Várias enzimas que participam do metabolismo do ácido araquidônico estão localizadas nos chamados corpúsculos lipídicos, encontrados no citoplasma de eosinófilos ativados. Os LTs na asma participam na contração da musculatura lisa brônquica, promovem a produção de muco, a descamação do epitélio brônquico e a redução do transporte mucociliar, alteram a permeabilidade vascular favorecendo o edema e a inflamação eosinofílica, aumentam a expressão de moléculas de adesão no endotélio vascular, favorecendo a marginação leucocitária e causam quimiotaxia específica (LTD4) para os eosinófilos.

As mais diversas funções dos eosinófilos são retratadas em seu amplo conjunto de moléculas de superfície e receptores que integram os eosinófilos com o sistema imune inato e adaptativo.27

O receptor considerado mais importante é o heterodimérico para IL-5, sendo a sua subunidade beta idêntica à subunidade beta dos receptores do GM-CSF e da IL-3 (ambos também presentes nas membranas das células eosinófilas). A subunidade alfa, IL-5Ra, é específica para IL-5 e foi identificada como um alvo terapêutico para asma eosinofílica grave e outras condições mediadas por eosinófilos. Os eosinófilos expressam receptores para IL-4, IL-13, IL-33, para o fator de crescimento transformador-ß (TGF-ß) e linfopoietina estromal tímica (TSLP).27

Os eosinófilos podem ampliar a cascata inflamatória produzindo agentes quimiotáxicos, como CCL5 (RANTES), CCL11 (eotaxina-1), CCL24 (eotaxina-2), CCL26 (eotaxina-3), CCL13 (MCP-4) e PAF, que aceleram a mobilização de novos eosinófilos e seus precursores para a circulação.28-30 Os níveis de RANTES, um produto das células T ativadas, encontram-se elevados nas vias aéreas de asmáticos atópicos e não-atópicos,  promovendo a infiltração de eosinófilos e células T.31 A expressão da RANTES tem sido localizada no músculo liso brônquico, nos eosinófilos e células T da submucosa. CCR1 é um receptor-chave de quimiocina nos eosinófilos, o qual é ativado pelo ligante de citocina 3 (CCL-3) e CCL-5. A eotaxina, uma quimiocina da família CC, é descrita como um agente quimiotáxico específico para eosinófilos.32 Após provocação alergênica, a expressão da eotaxina correlaciona-se com o número total de eosinófilos e de eosinófilos ativados, bem como com o nível de obstrução das vias aéreas de pacientes com asma. A CCL13 (MCP-4) é outra quimiocina que tem sido identificada nas vias aéreas, atuando em paralelo com a eotaxina em termos de recrutamento de eosinófilos.33  O receptor 3 da quimiocina CC (CCR3) é um importante receptor acoplado à proteína G nas membranas celulares dos eosinófilos e se liga a quimiocinas como MCP-3 e MCP-4. Os eosinófilos mantêm altos níveis de éter fosfolipídico (a forma estocada precursora do PAF) e produzem o PAF através da acetilação utilizando a enzima 1-alcalil-liso-sn-glicerol-3 fosfocolina: acetil-CoA acetil transferase. Os eosinófilos possuem receptores de superfície celular para mediadores lipídicos, como leucotrienos, prostaglandinas e PAF, todos os quais demonstraram ter um papel na fisiopatologia da asma.34-36 O PAF é um dos mais potentes agentes seletivos de quimiotaxia para os eosinófilos,37 sendo mais potente que a histamina e o LTB4. Quando liberado por eosinófilos no sítio da inflamação o PAF pode coestimular a quimiotaxia para eosinófilos e causar a liberação da enzima peroxidase eosinofílica (EPO).38 O Interferon-gama (IFN- γ), uma citocina tipo 1 secretada por eosinófilos, também pode ativá-los,39 e se encontra elevado no soro de alguns pacientes asmáticos graves,40 ressaltando a importância dessas vias na asma severa.

Os eosinófilos, juntamente com outras células estruturais e imunológicas, são uma fonte abundante de óxido nítrico sintase induzível (iNOS).32 Pela oxidação da L-arginina em L-citrulina, a iNOS sintetiza óxido nítrico (NO), uma importante molécula de sinalização, neurotransmissor e regulador imunológico e de defesa do hospedeiro.33 Altos níveis de NO derivado da iNOS estão fortemente associados à inflamação tipo 2 alta das vias aéreas na asma. Consequentemente, a fração exalada de NO (> 20-25 ppb) na respiração de pacientes com asma, juntamente com a eosinofilia do sangue periférico(150-300 µ/L), é usada como um biomarcador preditivo não invasivo, identificando aqueles pacientes que se beneficiarão de tratamento com drogas anti-inflamatórias, como os corticoides por inalação.43

In vitro diversas substâncias têm sido capazes de prolongar a sobrevida dos eosinófilos (antagonizam a apoptose) e estimular a degranulação, dentre elas a IL-3, IL-5, GM-CSF e complexos de imunoglobulinas. Recrutados na circulação, os eosinófilos maduros na presença de citocinas (IL-3, IL-5 e GM-CSF) mudam seu fenótipo para eosinófilos hipodensos, os quais apresentam maior tempo de sobrevida no tecido brônquico, retardando a apoptose por 7 a 14 dias.44-46 Estudos através de lavado broncoalveolar em pacientes com asma sintomáticos,18 apontam o GM-CSF como a citocina mais importante na sobrevida do eosinófilo, retardando a apoptose. Acredita-se que o GM-CSF seja sintetizado predominantemente pelo epitélio brônquico,47 ao nível da membrana basal, penetrando na luz brônquica mais facilmente que a IL-5, que é sintetizada na lâmina própria, abaixo da membrana basal. A IL-5 pode ter influência na sobrevida do eosinófilo principalmente na lâmina própria, enquanto que o GM-CSF atuaria no epitélio e luz brônquicos. O GM-CSF ativado do macrófago alveolar, obtido de pacientes com asma, é capaz de aumentar a fagocitose e a produção pelos eosinófilos de LTC4, de superóxidos, a atividade citotóxica e a degranulação induzida por imunoglobulinas.48,49 Os eosinófilos participam ainda das alterações estruturais crônicas das vias aéreas (remodelamento), possivelmente através da elaboração de citocinas pró-fibróticas como TGF-ß50 e MMP-9.51 O TGF-ß está implicado no remodelamento por meio da proliferação de fibroblastos e aumento da produção de colágeno e glicosaminoglicanos.52-53

Nas últimas décadas novas citocinas foram identificadas nos eosinófilos, como a IL-9, a IL-11 e o leukaemia inhibitory factor (LIF) e o já citado interferon-g.57 A IL-9 tem sido implicada como um componente importante nas doenças atópicas, pela sua capacidade de estimular a proliferação de células T, a produção de IgE e a proliferação e diferenciação de células hematopoéticas primitivas precursoras.55,56 A expressão da IL-11 mRNA em eosinófilos foi obtida em biópsias brônquicas de asmáticos atópicos e sugere um papel dos eosinófilos no remodelamento das vias aéreas.57 Tanto os eosinófilos de asmáticos atópicos como os de não atópicos expressam o LIF que, similarmente ao nerve growth factor (NGF), é capaz de induzir a liberação da EPO.58 A descrição da síntese de IFN-g mRNA e proteína pelos eosinófilos é até certo ponto intrigante e controverso, pois os eosinófilos secretam predominantemente citocinas tipo TH2.59 Estes autores propõem que os eosinófilos, como as células T, podem expressar citocinas tipo TH1 e TH2, embora outros pesquisadores tenham tido dificuldades em reproduzir estes resultados. Estes achados requerem novas investigações experimentais para confirmar a expressão de citocinas do tipo TH1 pelos eosinófilos e a potencial participação no contexto da inflamação alérgica. Outros mediadores dos eosinófilos importantes na patogênese da asma incluem a substância P (SP), peptídio relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) e neurocinina A (NkA).60

Siglec-8 é uma lectina semelhante à imunoglobulina do ácido siálico (uma proteína de ligação a carboidratos) expressa por eosinófilos, mastócitos e basófilos. Seu papel fisiológico ainda não foi identificado, embora se possa representar um potencial alvo terapêutico para doença mediada por eosinófilos, devido à observação de que a administração de um anticorpo direcionado contra Siglec-8 pode induzir apoptose seletiva de eosinófilos e inibir a degranulação de mastócitos.61

Os eosinófilos também expressam receptores para múltiplas outras citocinas e fatores de crescimento, inclusive para IL-4, IL-13, IL-33, linfopoetina estromal tímica (TSLP) e fator de crescimento transformador-ß (TGF-ß).

Os receptores de adesão, como o próprio nome sugere, permitem que células, como o eosinófilo, adiram à matriz extracelular (MEC) e a outras células. Eles também permitem que o eosinófilo perceba seu entorno e responda de acordo. Os receptores de adesão são divididos em quatro grupos principais: integrinas, caderinas, selectinas e immunoglobulin-like cell adhesion molecules (Ig-CAM). Integrinas e selectinas são as principais formas de receptores de adesão expressos em membranas celulares eosinofílicas.

Os eosinófilos expressam sete tipos de integrinas, que são glicoproteínas transmembrana, consistindo de uma cadeia α e ß.62 Os exemplos incluem very late antigen-4 (VLA-4, CD49d / CD29) e o complement receptor CR3 (CD11b / CD18), que é também conhecido como macrophage-1 antigen (Mac-1), alphaLbeta2 (CD11a/18), alphaXbeta2 (CD11c/18), alphaDbeta2 (CD11d /18) e alpha4beta7 (CD49d/beta7).63

As selectinas são glicoproteínas transmembranas de cadeia única com múltiplos domínios. Existem três famílias: E-, L- e P-selectinas; os dois últimos são expressos por eosinófilos humanos, enquanto que a E-selectina está presente no endotélio ativado.64

Evidências apontam que os eosinófilos são regulados pela IL-33 nos mecanismos de resposta inflamatória alérgica. A IL-33 pode ativar eosinófilos humanos in vitro.65-67 Após sua ligação aos receptores nos eosinófilos, as vias NF-kB e MAPK (mitogen-activated protein kinase) são ativadas,66 promovendo a expressão na superfície celular da ß2-integrina CD11b e molécula de adesão celular intercelular-1 (ICAM-1) e produção das citocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-8 e IL-13.65

A IL-33 induz eosinofilia sustentada in vivo,68-70 e a diferenciação de eosinófilos das células precursoras da medula óssea CD117+ de maneira dependente de IL-5 e independente de IL-13. Segundo Stolarski et al. a IL-33 é capaz de induzir a expansão de uma subpopulação de progenitores de granulócitos / monócitos CD117+ que foram caracterizados por sua dependência da IL-5.71,72 No entanto, não está claro se isso é alcançado de maneira direta ou indireta.

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Última Atualização: - 21/02/2021