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Asma Brônquica

Inflamação Alérgica

Interações: Célula Apresentadora de Antígenos, Linfócito T e a sua Ativação

Interações: Linfócito T Ativado e Linfócito B, sua Proliferação e Síntese de Anticorpos IgE

Imunoglobulina E

Mastócitos

Receptor para IgE – Receptor de Alta Afinidade FcεRI

Ativação, Regulação, Degranulação e Apoptose dos Mastócitos – Mediação via IgE

Interações entre a célula apresentadora de antígenos, o linfócito T e a sua ativação.

Na asma alérgica as células dendríticas são as principais células apresentadoras de antígenos (APCs) e entre as APCs são as  únicas  a ativar as células T naives. Derivam do precursor CD34+ da medula óssea, e correspondem a 0,2% dos leucócitos no sangue, onde transitam por curto espaço de tempo. Recebem esta denominação por apresentar longos braços, ou dendritos, sendo encontradas em vários tecidos, particularmente na pele e nas mucosas. Constitutivamente produzem um alto nível de proteínas MHC Classe II e a proteína co-estimuladora B-7, estando presentes em grande número no epitélio e submucosa das vias aéreas superiores e inferiores. A mucosa está coberta por uma extensa rede de células dendríticas, que se encontram nos canais para e intercelulares que circundam as células do epitélio basal. Nos brônquios, o espaço intercelular lateral é isolado do ambiente externo por união compacta do epitélio. Para interagir com as células dendríticas, potenciais aeroalérgenos devem atravessar o epitélio para alcançar este espaço. Em todos os tecidos não-linfóides, as células dendríticas encontram-se em estado latente, também conhecido como estado imaturo, especializado para a captação de antígenos, que pode ocorrer por três mecanismos: via endocitose receptor-mediada, envolvendo clathrin-coated; via macropinocitose e via fagocitose particulada.   

Outras APCs são também encontradas constitutivamente ou sob condições inflamatórias no trato respiratório, como os macrófagos, os linfócitos B e os pneumócitos tipo II, os quais apresentam também funções na atividade imune e de supressão.

As células dendríticas, em particular, participam na sensibilização alérgica primária e secundária. Durante a resposta primária, as células dendríticas provenientes da medula óssea são atraídas por quimiocinas inflamatórias MIP-3a (macrophage inflammatory protein) até os tecidos, onde capturam os antígenos. O reconhecimento do alérgeno constitui um sinal de alerta, que induz a maturação das células dendríticas. Migram até os linfáticos regionais, tornam-se responsivas às células de revestimento sinusoidal expressas no endotélio do linfático aferente e a MIP-3ß, expressa na área de células T dos linfonodos. Nos linfonodos as células dendríticas se agrupam. Caracterizam-se pela expressão constitutiva das moléculas do complexo principal de histocompatibilidade MHC classe II, e moléculas co-estimuladoras. Atraem e interagem com células T naives para induzir uma resposta imune primária, gerando células TH2 efetoras, e células T reguladoras que controlam a síntese de IgE pelos linfócitos B. As células TH2 efetoras por sua vez, migrarão via linfáticos eferentes para recirculação na corrente sangüínea. No caso de se depararem repetidamente ou continuadamente com o alérgeno, estes linfócitos TH2. stão disponíveis para migrar até os locais de inflamação e provavelmente podem ser estimulados pelas células dendríticas locais, que apresentam a IgE via receptor FcεRI, para gerar inflamação eosinofílica das vias aéreas, hiperplasia de células caliciformes e hiper-responsividade brônquica. As células dendríticas têm a capacidade de produzir monocyte deriveded chemokine (MDC) e thymus and activation regulated chemokine (TARC) que são quimiotáticos para as células TH2. a recirculação .

De forma sucinta abordaremos as múltiplas interações moleculares quando da apresentação de antígenos às células T (Figura 1).

As moléculas MHC classe II são proteínas heterodímeras, compostas por duas cadeias polipeptídicas a e b, cada qual contribuindo com um domínio ao sítio de ligação ao peptídeo e um domínio de suporte semelhante à imunoglobulina.  São sintetizadas no retículo endoplasmático da célula, de onde se transferem para o aparelho de Golgi, ligadas a uma terceira proteína chamada de cadeia invariante (Ii), que evita qualquer ligação prematura de peptídios endógenos ao seu sítio de ligação, até que ela atinja o local da degradação protéica extracelular. Uma segunda função da cadeia invariante é enviar moléculas MHC II para as vesículas endocíticas onde elas se ligam ao peptídeo. Do aparelho de Golgi, as MHC II são transferidas para vesículas onde se acumulam. Os peptídios antigênicos, provenientes de proteínas estranhas fagocitadas, degradadas e digeridas por enzimas proteolíticas da família das catepsinas, apresentam um tamanho que varia de 13-18 aminoácidos de comprimento e acumulam-se nos fagolisossomos da célula. Posteriormente as vesículas que contêm as MHC classe II se fundem com os lisossomos, em ambiente ácido, dissociando-se das cadeias Ii, permitindo que os peptídeos provenientes dos antígenos fagocitados se unam à fenda de ligação do peptídeo da molécula  MHC (2).  Os complexos resultantes desta fusão são carreados para a superfície destas células, onde linfócitos CD4 + T auxiliares (TH2) residentes intra-epiteliais os reconhecem através de receptores específicos de sua superfície (TCR), compostos heterodímeros constituídos por um par de cadeias polipeptídicas (a/ß ou γ/d) (17) cuja análise da seqüência de aminoácidos mostra uma grande similaridade com a estrutura domínio das imunoglobulinas. A ligação do TCR ao MHC + peptídio representa um complexo trimolecular.

A ativação das células T naives requer uma sinalização direta por duas vias: 

1. Através da ligação entre o TCR e o complexo MHC-II da célula apresentadora de antígeno e 
2. Pela via co-estimuladora através da família B7 e o CD28 dos linfócitos.

Uma vez que o TCR tenha reconhecido seu antígeno cognato apresentado pela molécula MHC II, o próximo passo é a transmissão de um sinal da superfície da célula, onde ocorre o reconhecimento até o núcleo da mesma, para que a célula T passe do estado “inativo” para o estado de “ativação”. Para isto, torna-se necessária a alteração na gene expressão no núcleo da célula. Normalmente este tipo de sinalização através da membrana celular envolve uma proteína transmembrana que apresenta duas partes: uma região externa (ligante), cuja função é a de ligar-se à molécula que está fora da célula e uma região interna que inicia a cascata bioquímica que conduz o sinal ao núcleo celular.

As cadeias aß do TCR apresentam um domínio extracelular  que se une ao seu ligante (combinação da molécula MHC e o peptídeo).
Os seus   prolongamentos internos citoplasmáticos são  muito curtos para qualquer sinalização, pois são constituídos  por apenas três aminoácidos. Esta sinalização prossegue através de um complexo de proteínas coletivamente chamado de CD3. O complexo CD3 é necessário para a transdução do sinal durante o processo de reconhecimento do antígeno, resultante de sua ligação ao TCR. Em humanos este complexo de sinalização é constituído por quatro diferentes polipeptídios: γ, d, ε e z (gama, delta, epsílon e zeta). Torna-se necessário salientar, todavia, que as proteínas γ e d que fazem parte do complexo CD3 não são as mesmas proteínas γ e d que constituem o γd TCR. As proteínas CD3 estão fixadas à membrana celular e apresentam prolongamentos citoplasmáticos que são suficientemente longos, recrutam enzimas quinases para iniciar o sinal de ativação e a transmissão do sinal para o núcleo (Figura 2).

Além de terem o TCR ligado ao complexo MHC-peptídio, as células T devem também receber sinais de co-estimulação antes que elas possam ser ativadas. O sinal de co-estimulação mais bem estudado é aquele constituído por uma família de moléculas expressa na superfície das APCs, chamada B7. As moléculas desta família, a B7-1 (CD80) e a B7-2 (CD86), produzem a co-estimulação das células T pela ligação a receptores de sua superfície. Dois destes receptores foram identificados: CD28 e CTLA-4 (cytolytic T lymphocyte associated antigen-4). A maioria das células T expressa o CD28, enquanto que o CTLA-4 somente é expresso após a ativação da célula, podendo funcionar como um regulador negativo (“desativador”). Além das moléculas B7, as APCs secretam citocinas que também contribuem para a co-estimulação. O que tem sido descrito é que diferentes APCs em diferentes lugares expressam diferentes combinações de moléculas co-estimuladoras e citocinas. Por exemplo, os macrófagos expressam B7-1 e a citocina IL-1; as células dendríticas expressam iguais quantidades de B7-1 e B7-2; as células B ativadas expressam mais B7-1 do que B7-2. A conclusão mais plausível é de que diferentes APCs produzem diferentes tipos de sinais de co-estimulação para as células T e estes diferentes sinais podem influenciar os tipos de citocinas que as células TH produzem.

Além da apresentação de antígenos peptídicos específicos por moléculas MHC, outros sinais são necessários para a ativação dos linfócitos T (CD25) como a IL-1 secretada pelas células dendríticas e a própria interação física entre as duas células. Uma vez ativados, os linfócitos T apresentam em sua superfície receptores para sua autoproliferação. Isto ocorre após as células T serem ativadas, pois necessitam proliferar (clonagem seletiva) e esta proliferação é acionada pelas citocinas como a IL-2 que atua como um fator de crescimento. As células T estimuladas via TCR, em ausência de sinais de co-estimulação, são incapazes de secretar a IL-2 e de ativar-se e por esta razão entram em um estado anérgico. As células T ativadas passam então a secretar citocinas necessárias para ativar os linfócitos B.

Interações entre o linfócito T ativado e o linfócito B, sua proliferação e síntese de anticorpos IgE.

Os linfócitos T induzem as células B a secretarem a imunoglobulina E (IgE) através do que se convencionou chamar de modelo dos dois sinais. O primeiro é fornecido pelas interleucinas 4 e 13 (IL-4 e IL-13) sintetizadas pelos linfócitos TH2. 18,19). Os mastócitos, os basófilos e os eosinófilos também produziem IL-4, enquanto que a IL-13 também é sintetizada pelas células NK. As IL-4 e IL-13 compartilham a cadeia α do receptor IL-4 (IL-4Ra), quando estas citocinas se ligam aos receptores nas células B. Uma vez acopladas, resulta a translocação para o núcleo do signal transduction-activated transcription (STAT-6), o qual estimula a transcrição do lócus do gene Cε, contendo seqüências  codificadoras (éxons) para as regiões constantes da cadeia pesada e da IgE. O segundo sinal ocorre, por contato, através da interação entre a proteína transmembrana chamada Ligante CD40 (CD40L ou CD154) expressa na superfície dos linfócitos T auxiliares ativados, com o receptor CD40, uma molécula co-estimuladora dos linfócitos B (6-8). Esta ação mútua entre as duas moléculas desencadeia  uma reorganização genética (deletion switch recombination) que aproxima todos os elementos da cadeia funcional pesada ε. O resultado é uma completa codificação genética multiéxon da cadeia pesada ε. A combinação destes dois sinais determina um desvio de classe para a IgE e proliferação das células B.   Interações adicionais entre outros pares de ligantes e receptores (entre B7-2/CD28 e B-7-2/CTLA-4 e entre a integrina a L ß₂ e a molécula de adesão intercelular 1 - ICAM-1) podem complementar ou upregulate a ativação dependente de célula T dos linfócitos B, que se segue à ligação do CD40 ao seu ligante. Os linfócitos B diferenciam-se em células secretoras de anticorpos (plasmócitos), cujo resultado é a expressão dos RNA mensageiros (curto e longo) da IgE e conseqüente síntese protéica da IgE específica para alérgenos específicos 
(Figura 3).

Uma vez sintetizados e ativados (um só linfócito B é capaz de produzir mais de 10 milhões de anticorpos por hora), os anticorpos IgE circulam por curto período de tempo no sangue antes de se ligarem aos receptores de alta afinidade (FcεRI) na superfície dos mastócitos teciduais, nos basófilos do sangue periférico e a receptores IgE de baixa afinidade (FcεRII, ou CD23) na superfície de linfócitos, eosinófilos, plaquetas e macrófagos.

Imunoglobulina E – IgE

Desde o final da década de 1960 a relação entre a síntese de anticorpos da classe IgE e a resposta imediata de hipersensibilidade contra alérgenos ambientais (sensibilização) está bem estabelecida. A IgE (o "E" foi escolhido devido ao eritema e pápula da reação cutânea alérgica) apresenta um peso molecular de 188 kDa. A sua concentração sérica normal no adulto varia de 17-450 ng e corresponde a 0,002% do total das imunoglobulinas. A meia-vida da IgE livre é de cerca de 2-3 dias, porém uma vez ligada aos seus receptores nos mastócitos e basófilos, mantém-se estável por semanas. A IgE é constituída por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas, sendo cada cadeia constituída por 110 aminoácidos, unidas por ligações covalentes, através de pontes dissulfeto. Cada cadeia apresenta uma região variável (V) e outra constante (C). O sítio de reconhecimento do antígeno ocorre na região variável, enquanto que na extremidade oposta acontece o acoplamento à célula, via receptores específicos de imunoglobulinas. A IgE caracteriza-se por apresentar uma longa região constante, com quatro domínios Cε1, Cε2, Cε3 e Cε4, ao contrário das outras imunoglobulinas que só possuem três. Este fato proporciona uma excepcional habilidade de acoplamento a receptores especializados de alta afinidade FcεRI. O exato local de união ocorre na seqüência N-terminal do terceiro domínio (Cε3) da cadeia pesada, perto da junção com Cε2 (Figura 4).

Uma reação dita precoce ou imediata se manifesta por aumento da resistência das vias aéreas, 10 a 15 minutos após contato com o alérgeno nos pacientes sensibilizados. Neste estágio a obstrução brônquica é reversível espontaneamente ou através de inalação de um broncodilatador.

Mastócitos

Imediatamente após a inalação do alérgeno, os mastócitos tipo MCT (fenótipo que contém triptase) no pulmão e os mastócitos tipo MCTC (fenótipo que contém triptase e quimase) predominante na mucosa nasal (9), sensibilizados previamente pela IgE, são ativados pelo acoplamento do antígeno (ligação cruzada) aos receptores IgE da superfície de sua membrana celular. Deve ser salientado que ambos os tipos de mastócitos expressam o receptor de alta afinidade  FcεRI e podem, portanto, participar das reações alérgicas dependentes da IgE. Funcionalmente, entretanto, os dois tipos de célula apresentam diferenças: o MCT está relacionado ao sistema imune, enquanto que o MCTC apresenta ações de angiogênese e remodelamento tecidual (p.ex. fibrose), sem ações imunológicas protetoras.

Os mastócitos originam-se na medula óssea, entram na circulação em pequeno número, como células mononucleares CD34+, antes que possam ser morfologicamente identificados. Expressam em sua superfície uma variedade de moléculas de adesão que podem promover sua fixação às outras células, incluindo em particular as células endoteliais. Migram para os tecidos sob influência de citocinas, onde sofrem processo de maturação até adquirirem seu fenótipo final, de acordo com o microambiente. Por último, os mastócitos apresentam a característica de migrar para a superfície epitelial das mucosas após provocação antigênica.

Nos pulmões, a reação antígeno-induzida determina a liberação de mediadores de um pequeno número de mastócitos localizados na luz brônquica, o que pode determinar aumento da permeabilidade local e aumentar a exposição antigênica aos mastócitos de localização mais profunda, como os da submucosa, os das glândulas mucosas e da musculatura lisa. Sua sobrevida varia de semanas a meses. Na mucosa das vias aéreas existem cerca de 20.000 mastócitos por mm³ (24) e representam 1 - 2% das células alveolares (Figura 5).  Provavelmente também proliferam nos tecidos.

Os mastócitos exibem um fenótipo heterogêneo e isto tem sido demonstrado em função de sua aparência quando corado e a seu conteúdo de proteoglicanos.  O proteoglicano dominante do mastócito humano é a heparina, que constitui mais de 75% do total, sendo o restante composto por  uma mistura de condroitina sulfatos. O mastócito das mucosas contém a protease triptase e tem sido funcionalmente associado ao sistema imunológico e a reações de defesa do hospedeiro.

Receptor para IgE - Receptor de alta afinidade FcεRI

O mastócito pode ser considerado como uma célula primária participante de reação alérgica precoce assim como de inflamação alérgica crônica. Possuem em sua superfície 10.000-100.000 receptores para a fração Fc da IgE (11). A IgE está fixada à membrana de mastócitos teciduais e basófilos circulantes (12,13), por um receptor tetrâmero de alta afinidade FcεRI (k_D = I-2 X 10^-9 M). Em asmáticos existe correlação entre a concentração de IgE e a hiper-responsividade brônquica (14) e o número de receptores de alta afinidade (13). Os receptores FcεRI (Figura 6) são compostos por quatro subunidades polipeptídicas (aβγ2): uma cadeia α, uma cadeia β e duas cadeias γ idênticas. A cadeia α com 260 aminoácidos tem um comprimento apreciável da seqüência extracelular, porém com curta seqüência citoplasmática.

A cadeia β com 263 aminoácidos transpõe a membrana celular quatro vezes e as duas cadeias γ com 86 aminoácidos se prolongam a considerável distância no citoplasma. O receptor FcεRI interage com os domínios C_H³/C_H³ e C_H⁴/C_H⁴ da molécula de IgE via dois domínios immunoglobulin-like da cadeia alfa. O FcεRI envolve um simples domínio Cε3, fazendo contato em ambos os lados ou interage com faces opostas do domínio Cε3 de um lado da IgE. As cadeias beta e gama estão envolvidas na transmissão de sinais que partem da superfície da célula, ocorrendo uma série de eventos na membrana e citoplasma (transdução de sinal, tradução e amplificação de sinal e ativação de proteínas alvos/efetoras) do mastócito, utilizando Ca ²⁺ e mecanismos energia-dependente
(Figura 7).

Ativação, regulação, degranulação e apoptose dos mastócitos – Mediação via IgE.

Os mastócitos são ativados pelo acoplamento do antígeno (ligação cruzada) (Figura 8) aos receptores IgE da superfície de sua membrana celular, resultando em agregação dos receptores FcεRI (alta afinidade para a região Fc da IgE) e através de uma sinalização intracelular, caracterizada pela fosforilação do ITAM (intacellular immunoreceptor tyrosine-based activation motif), domínios do receptor das cadeias- ß e -γ . A  agregação ativa o signal-initiating kinase , LYN, que fosforila tirosinas nas subunidades FcεRI-ß e - γ, criando sítios de ligação para o signal-propagating-kinase, SYK. O recrutamento e a ativação do SYK determina em minutos:

1.  A fosforilação da tirosina de várias proteínas de sinalização (isoformas da PLCγ (fosfolipase Cγ), PI3K ( phosphatidylinositol 3-kinase), VAV, GRB2 (growth factor receptor bound protein 2), LAT (linker for activation of T cells), Cbl e muitas outras),

2. A mobilização de  estoques de Ca²⁺ intracelular e extracelular,

3. Liberação de mediadores pela degranulação e

4. Aumento da adesão mediada via integrinas e produção de citocinas (dentro de horas).

Esta fosforilação ativa segundos mensageiros, resultando na formação de canais de cálcio (Ca²⁺), determinando influxo de Ca²⁺ para dentro da célula. A entrada do cálcio ocasiona a formação do ácido araquidônico e promove a formação de microtúbulos que são necessários para o movimento de grânulos até a membrana plasmática. A ligação cruzada do FcεRI ativa também a adeniciclase, desencadeando um aumento transitório no AMPc. A proteína-quinase-AMPc dependente fosforila as proteínas da membrana, resultando em expansão de mais de 1.000 grânulos secretórios dos mastócitos (Figura 9) e liberação de mediadores inflamatórios, que desencadeiam os sintomas e sinais das reações alérgicas. Os mastócitos sobrevivem a degranulação e refazem os estoques de mediadores nos grânulos secretórios.

Publicações recentes indicam que o monômero da IgE (ausência de acoplamento em ligação cruzada) pode tornar o mastócito resistente a apoptose induzida pela privação de fatores de crescimento in vitro e, sob certas circunstâncias, pode induzir a liberação de citocinas. Desta forma o acoplamento da IgE ao FcεRI pode influenciar a sobrevivência do mastócito direta ou indiretamente, podendo também regular a função celular. A ligação monomérica da IgE ao FcεRI aumenta a expressão do FcεRI na superfície, a qual está associada ao aumento da sensibilidade ao estímulo antigênico e ao aumento da produção de mediadores e citocinas após o acoplamento.

Dependendo das circunstâncias,  o acoplamento no FcεRI pode aumentar a sobrevivência ou a proliferação dos mastócitos, promover a apoptose ou não ter conseqüências na sobrevivência. As decisões sobre a sobrevivência ou morte dos mastócitos são influenciadas por vários fatores endógenos ou exógenos. Os fatores endógenos incluem as citocinas secretadas pela própria célula, receptores de citocinas, moléculas de adesão, caspases, proteínas da família BCL-2, moléculas de sinalização intracelular (proteínas e lipídeos) e fatores de transcrição.

Na Figura 10 são apresentadas com detalhes, as vias de ativação mediadas pela agregação FcεRI .

Os grânulos secretórios dos mastócitos contêm um complexo cristalino de mediadores pré-formados, ionicamente ligados a matriz de proteoglicanos.  Quando os mastócitos são ativados, os grânulos se expandem e movem-se em direção à  membrana celular. Após a fusão dos grânulos com a membrana celular, o conteúdo granular perde a natureza cristalina, o complexo se torna solúvel e os mediadores como a histamina, as proteases e os  proteoglicanos são liberados para o ambiente extracelular por um processo de difusão passiva, chamado de exocitose (Figura 9).

O mediador mais conhecido dos mastócitos é a histamina, que se encontra presente nos grânulos em concentrações de 100 nmol/l, equivalente a 1-4 pg por célula, dependendo do número de grânulos presentes. A histamina participa na reação alérgica imediata, desenvolvendo vasodilatação com aumento da permeabilidade vascular, contração da musculatura lisa brônquica e intestinal, e aumento da secreção de muco. Sua ação é curta pois a histamina é rapidamente metabolizada em 1-2 minutos, sendo  70% metabolizados pela histamina- N -metiltransferase e 30% pela diamino oxidase (histaminase). Os efeitos da histamina dependem do tipo de receptor encontrado nos tecidos: H1 - contração do músculo liso, H2 - dilatação dos vasos sangüíneos e H3 - inibição da liberação da noradrenalina.

Na atualidade credita-se aos mastócitos um papel bastante relevante na orquestração das respostas inflamatórias alérgicas pois, além do exposto, os mastócitos tanto em roedores como em humanos expressam moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), podendo ter participação na apresentação de antígenos às células T (15-17); secretando IL-4 e IL-13, podem manifestar potencial influência na produção de IgE pelos linfócitos B (18,19); e são também capazes de regular a diferenciação celular TH2 (20,21). Os  mastócitos podem causar mudanças estruturais via produção de laminina, colágeno IV e ativação de fibroblastos.

Os mediadores produzidos durante o processo de degranulação dos mastócitos podem ser divididos em quatro grupos (Tabela 1):

Moléculas pré-formadas e armazenadas nos grânulos;

Tabela 1 - Mediadores Liberados pelos Mastócitos

O lavado broncoalveolar, na fase precoce da asma (22), demonstra aumento das concentrações principalmente de triptase, histamina, LTC₄, LTD₄, LTE₄, PGD₂, PGF₂ (9-a, 11-ß) e tromboxane, todos potentes broncoconstritores, e que determinam também aumento da permeabilidade vascular, aumento da produção de muco e estimulação nervosa aferente.

O que até aqui foi descrito configura a resposta imediata que ocorre entre 10 e 15 minutos após exposição ao antígeno e que geralmente se resolve em duas horas. Um segundo período de broncoconstrição ocorre em 30 a 70% dos pacientes e configura a resposta asmática tardia, que se inicia 3 a 4 horas após a inalação, podendo durar mais de 24 horas (Figura 11).

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